問題及解答

產(chǎn)品相關(guān)問題及解答：

1. 常用酶的標(biāo)準(zhǔn)底物以及相關(guān)代謝工具

“+”表示存在。“空白”表示微量或不存在。

2. 貼壁肝細(xì)胞與懸浮肝細(xì)胞的區(qū)別？ 

答：貼壁細(xì)胞能夠在鋪了膠原的培養(yǎng)板上形成貼壁層，在換液操作時(shí)能夠保留在培養(yǎng)板的孔內(nèi)。主要適用于需要多次換液，較長時(shí)間培養(yǎng)的試驗(yàn)，如誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)運(yùn)體，HBV感染等。懸浮細(xì)胞是沒有貼壁能力的細(xì)胞，適合短時(shí)間實(shí)驗(yàn)（小于5小時(shí)），如代謝穩(wěn)定性，代謝產(chǎn)物鑒定，肝細(xì)胞攝取等試驗(yàn)。 

3. 肝細(xì)胞解凍操作步驟？ 

答：原代肝細(xì)胞在解凍時(shí)采取快融的策略。用鑷子等工具從液氮中拿出細(xì)胞后要首先在空氣中放置幾秒鐘讓液氮揮發(fā)，防止驟然升溫造成液氮噴出傷人或管壁裂開。再放入37°C中水浴約70-90秒，觀察到凍存管內(nèi)的細(xì)胞將要化凍還沒有成為液體時(shí)停止水浴最佳。IVT原代貼壁肝細(xì)胞無需離心處理，直接加入到plating media鋪板即可。

4. 該如何在肝細(xì)胞或微粒體中選擇體外代謝工具？

答：藥物通過肝細(xì)胞色素P450代謝是其主要的代謝途徑。微粒體含有全部CYP代謝酶能夠良好地預(yù)測體內(nèi)代謝的情況，方便試驗(yàn)與購買，是體外代謝研究的首選工具。肝細(xì)胞因其具有完全的細(xì)胞代謝功能，可以做微粒體代謝的補(bǔ)充。但是在做需要完全細(xì)胞生理功能的試驗(yàn)（如誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)運(yùn)體等）時(shí)需要選擇肝細(xì)胞作為研究工具，是微粒體所不能替代的。

5. 供體數(shù)和酶活不同的微粒體怎么選擇？

答：為消除試驗(yàn)材料的個(gè)體差異，將多供體混合在一起。參考FDA指導(dǎo)原則，在相關(guān)性分析法研究藥物代謝表型時(shí)可以選擇10個(gè)不同的供體進(jìn)行試驗(yàn)，所以在一般的代謝或抑制試驗(yàn)中可以選擇10個(gè)以上供體的微粒體均可進(jìn)行研究。

另外，做代謝穩(wěn)定性（Stability）實(shí)驗(yàn)以及代謝產(chǎn)物鑒定（MetID）實(shí)驗(yàn)，推薦使用高酶活（H-class）的微粒體，做CYP450抑制實(shí)驗(yàn)，建議用普通酶活的微粒體。

6. 微粒體如何進(jìn)行分裝保存？

答：微粒體一次實(shí)驗(yàn)用不完需要分裝保存的，建議化凍時(shí)候不要稀釋，直接將原液在冰上進(jìn)行分裝，將不用的部分寫好標(biāo)簽凍存在-80°C冰箱中。

7. 微粒體能凍融多少次？

答：微粒體一般凍融5次以內(nèi)不影響質(zhì)量。

8. 重組酶有高活性和低活性的有什么區(qū)別？實(shí)驗(yàn)時(shí)該如何選擇？

答：高活性的重組酶代謝速率較大，一般在較短的時(shí)間內(nèi)（如10min）代謝速率與孵育時(shí)間成線性。低活性重組酶在較長時(shí)間內(nèi)（如1h）具有良好的代謝速率與孵育時(shí)間成線性。低活性的重組酶更接近體內(nèi)環(huán)境。

9. 重組酶有+B5的，有不加b5的，有什么區(qū)別？

答：微粒體上天然水平的CYP 亞酶，在生理狀態(tài)下發(fā)生催化作用時(shí)伴隨生理水平的細(xì)胞色素b5，以及NADPH-CYP還原酶的輔助。為模擬生理狀態(tài)，在克隆代謝酶亞基因時(shí)會(huì)考慮同時(shí)克隆細(xì)胞色素b5和還原酶。這并不是發(fā)生催化反應(yīng)的必需條件，且不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

10. 培養(yǎng)液保質(zhì)期多久？加了抗生素以后？

答：培養(yǎng)液在2-8°C冰箱中可以放3個(gè)月。加入抗生素后貨架期為7天。

項(xiàng)目服務(wù)相關(guān)問題及解答：

1. 最新的NMPA和FDA指導(dǎo)原則要求做哪些轉(zhuǎn)運(yùn)體？試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)策略如何？

答：最新的NMPA和FDA指導(dǎo)原則規(guī)定的轉(zhuǎn)運(yùn)體包含：腸外排ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1，BCRP，肝SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1B1，OATP1B3，以及腎SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體OAT1，OAT3、OCT2、MATE1和MATE-2K這9個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)上轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制試驗(yàn)和底物試驗(yàn)都需要進(jìn)行研究。進(jìn)行抑制試驗(yàn)，以評估原研藥對已經(jīng)上市的藥物的影響；進(jìn)行底物研究以評估上市藥物對原研藥的影響?？蓛?yōu)先進(jìn)行抑制試驗(yàn)。

2. 代謝表型中設(shè)計(jì)原則？亞酶貢獻(xiàn)度計(jì)算方法？

答：代謝表型研究目前主要有4中鑒定方法，即相關(guān)性分析法、化學(xué)抑制法、抗體抑制法和重組酶法。用化學(xué)抑制法和重組酶法相結(jié)合比較好的選擇。在化學(xué)法定性處參與代謝的亞酶后，用相應(yīng)的重組酶進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行亞酶貢獻(xiàn)度計(jì)算。測定重組酶亞型對微粒體代謝候選藥物的貢獻(xiàn)率主要有重組酶豐度法、酶動(dòng)力學(xué)法、單抗抑制法、相對活性因子（RAF法）和系統(tǒng)間外推因子法（ISEF），最得到公認(rèn)的是RAF和ISEF法。

3. 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)mRNA與催化活性在誘導(dǎo)結(jié)論上不一致怎么辦？

答：最新DDI指導(dǎo)原則推薦采用mRNA倍數(shù)變化方法來判斷誘導(dǎo)作用，而對酶活性無明確標(biāo)準(zhǔn)。酶活性容易受到酶抑制、肝細(xì)胞毒性等影響，從而得到“假陰性”結(jié)果，因此從機(jī)制研究目的上來看，推薦采用mRNA表達(dá)量作為評價(jià)指標(biāo)。概括來說，mRNA偏向于機(jī)制研究，酶活性偏向于臨床意義評價(jià)。